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2018年3月10日，清華大學(xué)生命學(xué)院楊雪瑞課題組在Nucleic Acids Research雜志在線發(fā)表方法學(xué)論文“De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data”（文章鏈接），詳細(xì)介紹了一種使用核糖體分析（ribosome profiling）數(shù)據(jù)鑒定RNA的翻譯并重構(gòu)翻譯組的新方法，RiboCode。這是楊雪瑞課題組在翻譯組學(xué)研究領(lǐng)域的第二套信息挖掘方法。Ribosome profiling技術(shù)有兩個(gè)不同的應(yīng)用方向：翻譯速率的定量比較與翻譯事件的系統(tǒng)鑒定。此前，楊雪瑞課題組開發(fā)了ribosome profiling數(shù)據(jù)分析工具Xtail，用于基因翻譯速率的定量比較，文章發(fā)表于Nature Communications（文章鏈接）。此次發(fā)表的RiboCode工具則針對(duì)第二個(gè)應(yīng)用方向：鑒定RNA翻譯活性并構(gòu)建翻譯組。
RiboCode方法流程
近年來，越來越多的證據(jù)表明經(jīng)典的“編碼/非編碼基因”簡單二分法并不準(zhǔn)確?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的許多“非編碼”序列，如5’UTR（5’ untranslated region）、非編碼RNA（non-coding RNA）等，都存在開放讀碼框（open reading frame，ORF），其中一些ORF可能在特定條件下翻譯形成小肽或蛋白質(zhì)，并具有多種生物學(xué)功能。對(duì)于這些RNA來說，其翻譯與否和細(xì)胞狀態(tài)及環(huán)境相關(guān)，不能簡單歸類為編碼或非編碼RNA。因此，對(duì)轉(zhuǎn)錄組RNA中所有可能的ORF進(jìn)行翻譯活性的鑒定，構(gòu)建特定生理?xiàng)l件下細(xì)胞的翻譯組（translatome）成為RNA及蛋白質(zhì)相關(guān)研究領(lǐng)域的迫切需求。
使用RiboCode構(gòu)建酵母細(xì)胞翻譯組
楊雪瑞課題組的一個(gè)重要研究方向?yàn)槭褂胷ibosome profiling技術(shù)系統(tǒng)分析腫瘤、發(fā)育等復(fù)雜生物學(xué)過程中的翻譯調(diào)控機(jī)制，并同時(shí)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及數(shù)據(jù)分析方法的開發(fā)。Ribosome profiling通過對(duì)核糖體保護(hù)的RNA片段（ribosome protected fragment，RPF）的深度測(cè)序分析，提出基因組范圍的翻譯狀態(tài)圖譜。翻譯過程中，核糖體相對(duì)于RNA以密碼子長度（3 nt）為單位移動(dòng)。因此，以P-位點(diǎn)為基準(zhǔn)，來源于正常翻譯過程的RPF片段應(yīng)該在RNA上呈現(xiàn)3堿基的周期性分布。這是判斷一個(gè)RNA是否被翻譯的直接證據(jù)。但是，ribosome profiling數(shù)據(jù)遠(yuǎn)非如此理想，多種因素都可能干擾對(duì)翻譯的判斷，例如RPF總體分布不均勻、覆蓋率低、ORF長度差異大、P-位點(diǎn)判斷誤差、測(cè)序誤差、RNA片段污染等等。因此，從核糖體分析數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確鑒定具有翻譯活性的ORF需要高敏感、高準(zhǔn)確度的方法流程。
楊雪瑞課題組針對(duì)此需求，設(shè)計(jì)了RiboCode方法，用于從核糖體分析數(shù)據(jù)中鑒定有翻譯活性的RNA，最終構(gòu)建全面的翻譯組。在一系列測(cè)試中，RiboCode表現(xiàn)出優(yōu)異的準(zhǔn)確性、敏感性和分析效率，顯著超越了現(xiàn)有的其它方法。文章中使用RiboCode方法分析了多套人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、斑馬魚及酵母的ribosome profiling數(shù)據(jù)，鑒定了各種類型的非編碼RNA或非編碼片段的翻譯，其中絕大多數(shù)是此前從未被注釋過的。例如在酵母細(xì)胞中，RiboCode重構(gòu)了正常生理?xiàng)l件、氧化應(yīng)激、熱激三種狀態(tài)下的翻譯組，其中UTR區(qū)的翻譯，包括5’UTR的uORF及3’UTR的dORF，在應(yīng)激條件下明顯更加活躍，而且部分UTR的翻譯水平與mRNA上相應(yīng)的已知蛋白編碼區(qū)翻譯高度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。
總之，RiboCode方法幫助研究人員充分利用ribosome profiling這一技術(shù)挖掘細(xì)胞中的翻譯信號(hào)，并全面重構(gòu)特定生理狀態(tài)下的翻譯組，滿足了翻譯組學(xué)及RNA研究等領(lǐng)域的重大需求。該工具此前已向領(lǐng)域內(nèi)同行公開，在文章發(fā)表前已有近600次下載。RiboCode與此前發(fā)表的Xtail方法覆蓋了ribosome profiling數(shù)據(jù)的兩大主要分析方向：翻譯效率的定量比較與翻譯活性的系統(tǒng)鑒定。目前實(shí)驗(yàn)室正致力于使用這些工具協(xié)助針對(duì)腫瘤、發(fā)育等重要生物學(xué)過程的翻譯組學(xué)與翻譯調(diào)控機(jī)制研究。
清華大學(xué)生命學(xué)院2013級(jí)博士生肖正濤為本文的第一作者，楊雪瑞研究員為本文的通訊作者。研究工作得到了生命學(xué)院鄧海騰課題組在質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析方面的幫助。本研究由國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究”重點(diǎn)專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金委、青年千人計(jì)劃、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、清華大學(xué)自主科研項(xiàng)目提供經(jīng)費(fèi)支持。清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心生物計(jì)算平臺(tái)提供了計(jì)算資源的支持。
RiboCode文章鏈接：https://academic.oup.com/nar/advancearticle/doi/10.1093/nar/gky179/4925760